检测项目
蛋白质质量评估:主要检测蛋白质的纯度、浓度和完整性等。纯度可通过考马斯亮蓝染色法、银染法或 Western blotting 等方法进行评估,观察是否存在杂质蛋白或其他污染物;浓度可使用 Bradford 法、BCA 法等蛋白质定量试剂盒进行测定;完整性则可通过 SDS-PAGE 电泳观察蛋白质条带的分布和清晰程度来判断,若出现明显的拖尾或多条带现象,可能提示蛋白质存在降解或修饰。
特定蛋白质检测:根据具体的诊断需求,检测特定的蛋白质标志物,如肿瘤标志物、免疫相关蛋白等,可采用免疫组化、ELISA、质谱分析等方法,以确定组织中特定蛋白质的表达水平和存在情况。
检测范围
适用于分子体外诊断检验,包括医学实验室和分子病理学实验室进行的实验室自建检测项目,也适用于实验室客户、体外诊断开发者和制造商、生物库、从事生物医学研究的机构和商业组织以及监管机构,但不适用于基于免疫组织化学技术的蛋白质检测。
检测仪器
切片机:用于将福尔马林固定及石蜡包埋组织切成薄片,如徕卡 RM2235 切片机等,可精确地切出厚度均匀的组织切片,便于后续的处理和蛋白质提取。
脱蜡设备:如组织处理仪或恒温水浴锅等,用于去除组织切片中的石蜡,使蛋白质能够更好地暴露和提取。
蛋白质提取仪:可实现自动化的蛋白质提取过程,提高提取效率和重复性,如 Thermo Scientific 的 KingFisher 蛋白质提取仪等,能根据不同的样本类型和提取方法进行程序设定。
电泳仪及凝胶成像系统:用于 SDS-PAGE 电泳和 Western blotting 等实验,通过电泳将蛋白质在凝胶中分离,并利用凝胶成像系统观察蛋白质条带,如 Bio-Rad 的 Mini-PROTEAN Tetra 电泳系统和 ChemiDoc XRS + 凝胶成像系统等。
检测方法
组织切片预处理:将福尔马林固定及石蜡包埋组织切成厚度合适的切片,通常为 5-10μm,然后将切片置于二甲苯中脱蜡,再经过梯度乙醇水化,使组织恢复到水相状态,为后续的蛋白质提取做好准备。
蛋白质提取:可采用多种方法,如酚抽提法、RIPA 裂解液法、柱式提取法和磁珠提取法等。酚抽提法是利用酚和氯仿等有机溶剂将蛋白质从组织中提取出来;RIPA 裂解液法则是通过裂解液中的去污剂、盐等成分破坏细胞结构,释放出蛋白质;柱式提取法和磁珠提取法是利用特殊的吸附柱或磁珠与蛋白质结合,实现蛋白质的分离和纯化。
质量检测:通过 SDS-PAGE 电泳,将提取的蛋白质在电场作用下在聚丙烯酰胺凝胶中进行分离,完整的蛋白质会呈现出清晰的条带,根据条带的亮度、完整性和大小分布来判断蛋白质的质量;还可以利用 Bradford 法、BCA 法等蛋白质定量试剂盒检测蛋白质的浓度;对于特定蛋白质的检测,可采用免疫组化、ELISA、质谱分析等方法。
检测标准
本标准规定了在进行分子分析之前的检验前阶段,用于蛋白质检验的福尔马林固定和石蜡包埋组织标本的处理、记录、贮存及取材的指南,以确保样本的质量和稳定性,减少因操作不当导致的样本污染和降解等。规范性引用了 GB 19781-2005《医学实验室 安全要求》、GB/T 22576《医学实验室 质量和能力的专用要求》、GB/T 27020-2016《合格评定 各类检验机构的运作要求》、ISO 15189《医学实验室 质量和能力的特殊要求》、ISO 15190《医学实验室 安全要求》等标准。