检测产品项目

• 临床诊断：观察牛的体温、精神状态、眼口鼻黏膜等部位的症状，如高热、眼脸肿胀闭合、角膜混浊、口鼻部坏死、口腔黏膜溃疡等。

• 病理诊断：对病死牛的组织器官进行病理切片检查，观察病变特征，如脑组织的非化脓性脑膜脑炎、肺脏的纤维素性肺炎、肝脏的坏死灶等。

• 病原分离与鉴定：采集病牛的血液、脑、脾等组织，进行病毒分离培养和鉴定，确定是否存在恶性卡他热病毒。

• 病原核酸检测：通过聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量 PCR 等方法检测病牛组织或血液中的恶性卡他热病毒核酸。

• 血清学检测：包括病毒 — 血清中和试验、补体结合试验、间接免疫荧光试验、琼脂扩散试验、间接酶联免疫吸附试验等，检测牛血清中的特异性抗体。

标准

本标准规定了牛恶性卡他热的临床诊断、病理诊断、病原分离与鉴定、病原核酸检测以及血清学检测的技术要求。适用于牛恶性卡他热的临床诊断、实验室检测、流行病学调查以及检验检疫。

方法

• 临床诊断方法：观察牛的临床症状，如体温升高达到 41℃-42℃，呈稽留热，体质迅速虚弱，眼、口、鼻黏膜出现严重炎症，双眼流泪、眼脸肿胀闭合、有纤维素性脓性分泌物流出，角膜混浊甚至溃疡失明，口腔黏膜溃疡、坏死，流涎，呼吸困难，腹泻等。结合流行病学资料，如是否与绵羊接触史等，进行初步诊断。

• 病理诊断方法：对病死牛进行剖检，观察各组织器官的病变。如脑组织可见非化脓性脑膜脑炎，血管周围有淋巴细胞和单核细胞浸润；肺脏呈纤维素性肺炎，有大量纤维素渗出和炎症细胞浸润；肝脏有坏死灶，周围有淋巴细胞和巨噬细胞聚集等。取病变组织制作病理切片，经苏木精 - 伊红染色后，在显微镜下观察病理变化，为诊断提供依据。

• 病原分离与鉴定方法：

• 采样：采集病牛的血液、脑、脾等组织。

• 处理：将采集的组织样本研磨制成悬液，离心后取上清液。

• 接种：将上清液接种到适宜的细胞培养物中，如牛肾细胞、羊肾细胞等，观察细胞病变效应（CPE）。

• 鉴定：通过电子显微镜观察病毒粒子的形态、大小和结构，或者采用免疫荧光抗体试验、免疫酶标试验等方法对分离的病毒进行鉴定。

• 病原核酸检测方法：

• 采样：采集病牛的血液、组织等样本，提取其中的核酸。

• 引物设计：根据牛恶性卡他热病毒的特定基因序列设计引物。

• PCR 反应：将提取的核酸作为模板，加入引物、dNTP、Taq 酶等反应成分，进行 PCR 扩增。反应条件一般包括预变性、变性、退火、延伸等步骤，具体参数根据引物和模板的特性进行优化。

• 结果分析：通过琼脂糖凝胶电泳或荧光定量 PCR 等方法对 PCR 产物进行分析。如果扩增出预期大小的特异性条带或荧光信号达到一定阈值，则判断为阳性。

• 血清学检测方法：

• 病毒 — 血清中和试验：将已知病毒液与待检血清混合，接种到敏感细胞或动物体内，观察是否出现中和反应，即病毒的感染性被抑制。

• 补体结合试验：利用抗原与抗体特异性结合形成复合物后能结合补体的原理，通过观察补体是否被结合来判断血清中是否存在抗体。

• 间接免疫荧光试验：将病毒抗原固定在载玻片上，与待检血清反应，然后加入荧光标记的二抗，在荧光显微镜下观察。如果出现特异性荧光，则表明血清中含有病毒抗体。

• 琼脂扩散试验：将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶板的不同孔中，在一定条件下，抗原和抗体向周围扩散，若两者相遇并特异性结合，则在两者之间形成沉淀线。

• 间接酶联免疫吸附试验：将病毒抗原包被在酶标板上，与待检血清反应，然后加入酶标记的二抗，通过酶催化底物显色，用酶标仪测定吸光度值。根据标准曲线或临界值判断血清中是否存在抗体。